百螢課堂之APC與抗體的綴合實驗方案

注1:整個綴合過程可以在內(nèi)完成。但是，綴合前對apc的純化可能需要24-48小時。除了下面
列出的材料外，您還需要濃度至少為2mg/ml的抗體溶液。請您在進行apc抗體綴合實驗之前熟悉
如何使用脫鹽柱以及如何吸光度光譜。
注2:smcc-apc綴合物非常穩(wěn)定(在“交換緩沖液”中，在4℃下至少可以穩(wěn)定幾個月)。因此，如果您需要節(jié)省一部分時間，可以選擇同時綴合10毫克或多的apc,并將其用于幾次抗體實驗(在幾周內(nèi))。
一.apc的制備
1.將apc純化。綴合前的濃度通常為5-10mg/ml。
注意：apc在綴合前作為sas(銨鈉)沉淀物穩(wěn)定。如果將apc以sas沉淀物的形式儲存，則在使用前進行大量純化。在用每毫升1升的“透析緩沖液”透析之前，用每毫升1升apc的pbs進行透析2 次。
2.使用1.7毫克apc修飾每毫克lgg, 包括在緩沖液交換過程中損失的額外10%。
3.檢查apc的純度和濃度，請測量280、620和655nm處的吸光度。(1mg/ml的apc在655nm處的od為5.9) 。 655/620比率>1.4表明雜質(zhì)被充分去除；655/280比率>4表明所有其他蛋白質(zhì)均已充分去除。
二.apc的活化
1.使用前在無水dmso中制備10mg/ml的smcc儲備溶液。
2.每毫克apc加入6μlsmcc,并進行渦旋。將反應(yīng)管用鋁箔包好，室溫下旋轉(zhuǎn)60分鐘。
3.將純化的 apc過凝膠過濾柱來交換緩沖液。
注意：對于失敗或效果較差的結(jié)合，增加或減少smcc相對于apc的量，可能會有所好轉(zhuǎn)。
三.1gg 還原
1.在蒸餾水中制備1m dtt(15.4 mg/100 μl) 的新鮮溶液。
2.1gg溶液濃度應(yīng)為 4 mg/ml或高，這樣效果比較好。還原幾乎可以在任何緩沖液中進行；mes 、磷酸鹽和 tris 緩沖液(ph 范圍為6至8)已被驗證可以使用。如果抗體濃度2mg/ml，則應(yīng)濃縮。緩沖液交換柱上的損失應(yīng)額外增加10%。
3.用dtt配制20mmlgg溶液：每毫升 igg溶液加入20μldtt 原液并攪拌。室溫下靜置30分鐘，額外攪拌 (以盡量減少半胱酸再氧化為胱酸)。
4.將還原的lgg 通過預(yù)平衡的“交換緩沖液”過濾柱。收集0.25毫升的級分，測定蛋白濃度，并將含
有大部分lgg 的級分匯集在一起?？梢酝ㄟ^分光光度法或比色法完成。
5.此步驟后盡快進行綴合。
注意：對于結(jié)合較差或失敗的情況，降低 dtt濃度可能會有所幫助。
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